新型ATP食品卫生检测仪的研制

1、引言

食品安全是一个直接关系到人民群众生命健康和社会稳定的重大公共安全问题，而细菌性污染又是其中极为重要的因素。如何能够快速、有效的检测食品中细菌的含量，是当今食品安全必然涉及的技术课题。目前检测细菌含量的主要方法如下：

（1）传统培养检测方法：传统培养法检测被称为“金标方法”，但其培养时间长且对检测条件以及检测人员的专业水平要求较高。

（2）ATP(三磷酸腺苷)生物化学发光法：利用细胞的特征来测定细菌数，是快速检测菌落总数的一个发展方向。这种方法可以在几分钟内得出结果，大大缩短了检测时间。

（3）其他检测方法：除了上述两种检测方法外，还有许多检测方法正在迅速发展。其中包括免疫学方法，分子生物学方法以及其他生物化学方法[1]。这些检测方法各有千秋，但许多检测方法或因设备试剂比较昂贵、或因操作过程复杂、或因实验条件较为严格，不适用于食品卫生状况的现场检测。

可见ATP生物化学发光法具有极大的优点。但是目前大部分ATP卫生检测仪采用了光电倍增管（PMT）作为荧光探测器[2-3]，闪光型荧光素酶作为检测试剂，导致体积较大，价格昂贵，仅适合实验室的验证工作，极大的限制了其在食品生产卫生检测过程中的应用。为了克服其缺点，本文采用新型硅光电二极管作为荧光探测器，辉光型荧光素酶作为检测试剂，设计出一种新型的ATP食品卫生检测仪，具有便携性、功耗低、高灵敏度和速度快的优点。

2、ATP生物化学发光检测方案

2.1 ATP生物化学发光检测原理

ATP是包括微生物在内的一切活生物细胞能量的来源。它在虫荧光素酶的催化作用下，与荧光素在有氧环境及二价镁离子的作用下释放出荧光，其反应式为[4]：

强度呈线性关系，用光度计测出发光强度，也就得到了细菌总数[5]。这种方法可以在几分钟内得到结果，大大缩短了检测时间。

2.2 ATP生物发光酶的选择

当前商业化的ATP萤火虫荧光素-虫荧光素酶主要分为闪光型和辉光型两种：

（1）闪光型（Flash） 光在几秒钟内就能发射完。发光过程中光强很快到达峰值然后迅速下降（1-3s）[2]。

（2）辉光型（Glow） 有些商业化的荧光素酶检测系统采用特殊的方法，使得酶的活性高，产生的光强度强，在测试的几分钟之内可以保持稳定。

由于闪光型发光持续时间短，对此类型光进行测试必须要采用自动加样系统，这使得检测仪的体积增大，携带不方便，不利于对食品生产环境进行实时现场检测。本文采用辉光型酶作为检测试剂，只要在两分钟之内对试样检测即可，不需要自动加样系统克服了闪光型酶的缺点。

3、系统设计

3.1 硬件设计

仪器的硬件部分主要由取样测试室、电源模块、微弱荧光检测模块、校准模块、单片机控制模块、通信模块和人机对话模块等部分组成。仪器硬件结构如图1所示。



此测试仪在设计过程中面临的两个突出的难点在于仪器近乎苛刻的超低功耗要求和对超微弱荧光的检测。针对这两点，本文对电源模块和微弱荧光检测模块采取如下设计方案。

（1）电源模块 由于仪器的便携特性，采用两节普通的1.5V碱性电池作为仪器的电源。利用具有电池反接保护功能的升压开关电源芯片MAX1833，将电池电压转化整个硬件系统的3.3V工作电压，和最大150mA的电流输出。此芯片静态电流为4μA，关断电流小于1μA，电源转换效率高达90%。

微弱荧光检测模块需要精度和稳定性要求更高的电源供电，本文选用美国国家半导体公司生产的低压差线形稳压芯片LP2982，可提供精准的3V电压和最大50mA的电流输出，具有输出电压精度1%，低噪声和关断电流小于1μA等特点。电源模块电路如图2所示。



以上供电模块的设计，具有电源转换效率高，静态漏电流低等优点。计算证明这样的设计可使仪器待机长达6个月。

（2）微弱荧光检测模块 传统ATP检测仪采用PMT作为光电传感器，对试样所发出的荧光强度进行检测。由于PMT工作时需要正负高压电源供电，使得用其作为光电探测器的卫生检测仪体积较大且价格昂贵，不方便携带，极大的限制了此种检测仪的应用。本文采用日本滨松生产的s1227系列硅光电二极管作为光电传感器，具有体积较小，灵敏度高，暗电流小等优点。与PMT相比，硅光电二极管本身没有电流的放大作用，因此需要设计良好的放大电路将光电二极管输出的微弱电流进行放大。本文采取以下两种措施，很好的解决了微弱电流信号的放大问题：

① 选用高性能的集成运算放大器 本文采用ADI公司生产的AD8605运算放大器芯片作为放大器。此放大器具有偏置电压低，输入电流低（pA级），电压电流噪声低等优点，是光电二极管放大电路的最佳选择。光电二极管采用光伏模式，可以非常精确的线性工作，无暗电流，整个电路的噪声低。

② 对整个微弱荧光检测模块进行屏蔽 本文采用的特殊设计的铝壳进行屏蔽的方法取得了很好的效果。信号放大后，由具有16位Δ-ΣA/D转换器的MAX1407数据采集芯片进行采样。整个信号调理电路如图3所示。



此外，放大器的增益漂移也是一个必须考虑的问题。本文设计了校准模块来解决此问题：

光电二极管内阻和反馈电阻R的温度特性会导致整个电路的放大倍数随着温度而变化。本文采用绿光LED（发射出560nm左右的光，与ATP生物化学发光光谱非常匹配）作为校准光源来解决此问题。LED发光具有稳定的低漂移，在一定范围内发光强度与电流成正比。设电流为I1，I2为通过LED的电流，放大电路输出电压分别为V1，V2，利用公式（1）：



可以计算出当前环境下的放大系数β，与标准放大倍数相乘就可以得到当前放大倍数。此校准模块，具有自动校准的特点，不需要人工干预。

采用6键簿膜开关作为仪器的输入部分，输出部分为字符型LCD。具有打印接口以及与上位机进行通信的RS232接口。按键少，界面友好，操作简单。

3.2 软件设计

由于整个系统功能比较复杂，为了充分利用系统的硬件资源，方便对程序的管理以及升级，仪器采用μC/OS-II嵌入式操作系统管理整个软件系统。整个软件系统采用三层结构，由内向外分别是操作系统层、应用层、硬件层，如图4所示。



应用层是依据系统的基本功能以及对硬件的依赖来划分的。主要有以下五个任务：信号采集处理任务、命令处理任务、显示任务、数据存储任务和通信任务。根据自身的性质和对实时性要求的不同，应对这五项任务分配不同的优先级。

（1）信号采集处理任务 控制MAX1407对试样的发光值进行采样并对获得的数据进行处理。是整个系统的核心，在本系统中具有最高优先级。平时处于挂起状态，由命令处理任务激活,数据采集完成后，激活数据存储任务，然后挂起。

（2）命令处理任务 根据键值和系统当前所处状态激活其他任务，任务优先级较高，在本系统中处于第二优先级。

（3）显示任务 在LCD上实时显示各种数据及状态，任务优先级较高，为第三优先级。

（4）数据存储任务 通过SPI总线与25AA640芯片进行通信，存储检测数据。

（5）通信任务 与上位机通信，传送检测数据或接收上位机命令。

系统运行时，首先进行系统初始化操作，即初始化所有数据结构，分配堆栈空间，然后建立任务间通信的信号量或者消息邮箱，进而创建任务，所有任务被置于就绪态。多任务环境开始运行，命令处理任务根据键盘状态激活其他任务，从而实现系统的各个功能。

4、测量结果与分析

常见的微生物如真菌类，其ATP含量的数量级为10-11mol/细胞，细菌类为10-18mol/细胞[5]。根据食品生产过程中对环境卫生的要求，本仪器的设计目标是能够准确检测10-15-10-11mol的ATP。当ATP的量在此范围时，仪器应该具有良好的重复性和线性。

为了测试仪器的性能，采用美国普洛麦格公司生产的辉光型荧光素-荧光素酶作为检测试剂，将配置的不同量的ATP标准液（10-16-10-7mol）加入到萤火虫-荧光素酶中，用仪器进行测量。为了避免偶然性，对不同数量级的ATP量进行多次试验。将测到的数据进行处理，绘制不同物质的量的ATP与发光值的对应曲线如图5所示：



可以看出，发光曲线明显的分为三个部分，下面分别对这三个部分进行分析：

（1）区域A 此部分发光量随ATP量的增加而稍微增加但不成线性关系。这是因为仪器和酶存在背景噪声，当ATP的量很小时，发出的光十分微弱，被背景噪声淹没。

（2）区域B 在此区域内发光量与ATP的量成7个数量级的线性关系。因此，可以用发光值作为评判ATP量的方法之一。

（3）区域C 在此区域内的ATP量大，而参与反应的酶的含量一定，造成ATP剩余，发光量渐趋饱和。

由测量曲线可以得出，本文所设计的ATP食品卫生检测仪在检测10-15-10-11mol量的ATP时，具有良好的线性和可重复性，达到了设计要求。因此，本检测仪可以实现对细菌含量的现场快速检测。

5、结论

本仪器采用ATP生物化学发光法与嵌入式系统相结合的方法，使得对微生物含量的检测时间大大缩短，只需要两分钟即可得到测试结果。特别由于采用硅光电二极管作为光电传感器，解决了通常使用PMT光电倍增管体积大，价格昂贵，不方便携带的缺点。测试仪的体积小，方便携带，功耗低，待机时间长，检测精度高，能够方便的对试样进行实时检测，在食品生产卫生检测领域具有很好的应用前景。