基于高内涵显微成像流式细胞仪的免疫学研究方案

感染时初始CD8+T细胞被激活、增殖分化为效应CD8+T细胞，并伴随体温升高。要知道体温升高是否会进一步调控CD8+T细胞的激活分化，首先要解决对T细胞激活分化过程中的形态学变化进行定量分析。

Amnis公司ImageStream高内涵显微成像流式细胞仪结合荧光显微镜和流式细胞仪的优点，可在快速分析大量细胞的同时获得每个细胞的图像，进行客观定量的分析。我们知道，发烧的时候是机体正在对外来病原菌进行抵抗。以往我们只是知道高温能够抑制病原菌的复制能力。但是来自于美国纽约的罗兹韦尔公园癌症研究所(RPCI)的免疫与流式细胞仪研究组近日的研究表明，发烧还能够提高免疫系统的功能，确切的说，是CD8+T细胞的功能[Thomas A. Mace, JLB,2011]。

在这篇研究中，美国Amnis公司的ImageStream高内涵显微成像流式细胞仪发挥了不可估量的作用，不仅完美的解决了传统的流式分析和传统图像观察的技术瓶颈，而且其强大的图像定量分析能力也使之成为免疫学研究的利器。在炎症或者受到病原菌侵染的时候，初始CD8+T细胞通过与APC细胞相互作用而被激活，进而增值、分化为效应CD8+T细胞，此激活过程可能会伴随着体温的升高。但是人们仍不了解体温的升高是否又会进一步调控CD8+T细胞的激活和分化。

要解决这一问题，首先要解决的是如何对T细胞的激活和分化过程中的形态学变化进行定量分析。而美国Amnis公司推出的ImageStream高内涵显微成像流式细胞仪使得这一问题迎刃而解：该系统结合了荧光显微镜和流式细胞仪的优点，能够在快速分析大量的细胞的同时获得每个细胞的图像，并可以对这些图像进行客观、定量的分析。

近日，美国纽约的罗兹韦尔公园癌症研究所《白细胞生物学杂志》杂志上发表了他们的研究结果：研究者利用ImageStream高内涵显微成像流式细胞仪对较低体温(33°C和37°C)以及较高体温(39.5°C)下小鼠CD8+T细胞与APC细胞的结合情况进行了定量分析，结果表明，体温升高后增强了二者的结合率。

另外更重要的是，研究者还发现实验组小鼠CD8+T细胞数量显着增加，并且其膜表面的GM1以及CD8共受体聚集成簇从而影响了膜的流动性。这些结果揭示了发烧引起的体温增加能够通过提高效应细胞群体的数量来影响抗原特异性CD8+T细胞所调节的应激效应。在该研究中，ImageStream显示了其强大的图像定量分析能力。

研究者首先从实验小鼠体内分离了初始CD8+T细胞，然后分别在33°C、37°C以及39.5°C孵育6小时后，通过用ImageStream分析其细胞膜的流动性。由于ImageStream能够对检测到细胞进行成像，所以可以直观的显示出FITC标记的GM1蛋白均匀分布或成簇分布的情况(图1B)。


通过软件对整个群体细胞进行定量的图像分析，研究者利用ImageStream软件中的BrightDetail Intensity参数对细胞进行分析，发现温度升高至39.5°C后细胞膜表面的GM1成簇现象明显增加(图1C)。另外，有报道表明T细胞激活时TCR信号复合体也会在细胞膜表面成簇。因此，研究者也对该复合体进行了分析，同样获得了类似的结果(图1G和图H)。

为了检测温度是否会影响CD8+T细胞与APC细胞二连体的形成，研究者将初始CD8+T细胞分别在37°或39.5°C 孵育6小时，然后和C57BL/6脾细胞共培养，实验组用gp10025-33多肽处理。最后用ImageStream对发生免疫突触的二连体细胞的数量进行分析。

首先通过明场和Aspect Ratio(细胞的短轴/长轴)设门区分单细胞和二连体细胞(图2A和B，R1为单细胞，R2为二连体细胞)，然后通过CD8+Thy1.1+ (即 CD8+ T cells)和CD11b+ (即APC) 的表达进行设门圈选出T细胞和APC的双联体细胞(图2C)。实验结果表明，温度的升高使CD8+T细胞与APC二连体细胞的比例显着增加(图2D)。



图2.温度的升高导致CD8+T细胞和APC细胞的二连体的比例增加

接下来，研究者希望探究CD8+T细胞的共受体是否也会随着温度的增加而聚集成簇。该共受体分子也和TCRβ一样，是对CD8+T细胞激活非常重要的分子。通过研究证实了作者的猜测(图3A和3B)。


图3.小鼠的升高导致CD8+T细胞膜表面共受体成簇比例增加

同时研究者还利用ImageStream软件中的Similarity参数对CD8共受体与GM1在细胞膜共定位情况进行了分析，但是结果表明小鼠体温增加前后的similarity值没有差异(数据未显示)。为了进一步研究GM1在T细胞中的成簇情况，研究者分析了GM1和阴性对照CD71的共定位情况，结果表明在小鼠体温增加前后similarity的值有所下降(右图C和D)。图像显示CD71分子在小鼠体温升高后并没有和GM1共成簇(cocluster)，如右图E所示。


最后，研究者认为CD8+T细胞及其分化为效应细胞的过程是对温度敏感的。如果CD8+T细胞先处于较高的温度下，然后接受到抗原刺激时会更加快速和有效的作出响应。在此类免疫学研究中，研究者遇到的最大的技术瓶颈就是如何对大量的细胞图像进行定量分析并且获得具有统计学意义的数据-因为传统的流式细胞仪无法获得细胞的形态学信息，而采用荧光显微镜需要通过人为进行判断分析，统计的细胞数量非常有限。而美国Amnis公司推出的ImageStream高内涵显微成像流式细胞仪完美的解决了这一问题，能够快速、客观的对蛋白转位、分子共定位、形态改变、分子内吞、免疫突触形成等形态学进行定量分析。